一、細(xì)胞永生化介紹、

  細(xì)胞永生化（Cell immortalization）是指體外培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過自發(fā)的或受外界因素的影響從增殖衰老危機(jī)中逃離，從而具有無限增殖能力的過程。正常組織來源的細(xì)胞在通常的體外培養(yǎng)條件下可分裂生長，但經(jīng)過有限次數(shù)的傳代后，就會(huì)停止增殖，發(fā)生衰老和死亡。利用基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因?qū)肽康募?xì)胞內(nèi)，從而建立永生化細(xì)胞株，以達(dá)到使體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有無限增殖能力且細(xì)胞間無差異的目的。對(duì)細(xì)胞永生化進(jìn)行深入研究，不僅有利于我們了解細(xì)胞增殖與衰老的分子機(jī)制，而且為探尋腫瘤治療及器官移植的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外，由于永生化細(xì)胞具有可以多次傳代的特性，可以利用各種細(xì)胞永生化的方法使那些傳代困難、增殖緩慢、容易衰老的細(xì)胞獲得永生，從而為研究人員提供更多的細(xì)胞資源。

二、永生化細(xì)胞株的建立方法

  由于體外培養(yǎng)細(xì)胞自發(fā)性永生化率非常低，目前普遍采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源性永生化基因?qū)肽康募?xì)胞內(nèi), 以增加永生化。永生化相關(guān)的外源基因。

以SV40過表達(dá)慢病毒為例：

1．轉(zhuǎn)染

（1）將細(xì)胞接種6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105 個(gè)，

（2）第二天，待細(xì)胞貼壁后，換液，

（3）加入1mL完全培養(yǎng)基，再加20 μL SV40過表達(dá)慢病毒，

（4）混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，

（5）12h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，并更換為新鮮培養(yǎng)基，

（6）當(dāng)細(xì)胞長滿板底后，傳代至T25培養(yǎng)瓶中。

2.篩選

2.1殺滅曲線的確定

（1）將未轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜，

（2）第二天，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基，

（3）將含不同濃度嘌呤霉素（1ug/mL，2ug/mL，3ug/mL，4ug/mL，5 ug/mL，6ug/mL，7ug/mL）的新鮮培養(yǎng)基加入已鋪有細(xì)胞的24孔板，

（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，

（5）每天觀察細(xì)胞的存活比例，

（6）最小的嘌呤霉素使用濃度就是從嘌呤霉素篩選開始1-4d內(nèi)殺死所有細(xì)胞的最低篩選濃度。

結(jié)果：嘌呤霉素的使用濃度為2ug/mL，作用時(shí)間為3d。

2.2嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞

（1）第一天，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜

（2）第二天，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基，

（3）加入含嘌呤霉素（2ug/mL）的篩選培養(yǎng)基，孵育，

（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，

（5）每天觀察細(xì)胞的存活比例，

（6）在同一時(shí)間點(diǎn)（3d）存活的細(xì)胞，即為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，

（7）對(duì)篩選后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。

三、詢價(jià)及訂購

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