1. 注意事項(xiàng)
1.1. 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài)，約為80 – 90 ％致密度。
1.2. 冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
1.3. 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色(以0.22 micron FGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小體積分裝，4 oC 避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽
滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。
1.4. 冷凍保存之細(xì)胞濃度：
1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后死去。
1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106 cells/ml。
1.5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 或10 ％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗。
1.6. 冷凍方法：
1.6.1. 傳統(tǒng)方法: 4 oC 10 分鐘---> -20 oC 30 分鐘---> -80 oC 16 - 18 小時(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 長期儲存。
1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機(jī)以–1 ～ -3 oC/分鐘之速度由室溫降至–120 oC，放在液氮槽vapor phase 長期儲存。
適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存。
2. 材料
2.1. 生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞
2.2. 新鮮培養(yǎng)基
2.3. DMSO (Sigma D-2650)
2.4. 無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)
2.5. 0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.6. 血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片
2.7. 等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II)
3. 步驟
3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形。
3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10％，混合均勻，置于室溫下待用。
3.3. 依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1 ml) 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻 分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。
3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 oC 10 分鐘→ -20 oC 30 分鐘→ -80 oC 16～18 小時(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長期儲存。
3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中，再放入液氮槽中。程序?yàn)? program 7: HB CELL
