現(xiàn)代生物技術(shù)均通過(guò)細(xì)胞作為載體來(lái)進(jìn)行，無(wú)論是基因治療、干細(xì)胞、克隆技術(shù)都在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的。細(xì)胞的生長(zhǎng)需要一定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，用于維持細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)稱(chēng)為培養(yǎng)基，即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng)、保存細(xì)胞用的物質(zhì)，就其本意上講為人工模擬體內(nèi)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，使細(xì)胞在此環(huán)境中有生長(zhǎng)和繁殖的能力。它是提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。細(xì)胞培養(yǎng)基其組成成分主要有：水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)離子及其他一些入核酸降解物、激素等。
隨著動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展，作為細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中最基本的原料－細(xì)胞培養(yǎng)基的用量也迅速增加，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)科和醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，如疫苗生產(chǎn)（人用疫苗如乙腦、狂犬、甲肝、乙肝、出血熱、麻疹等，獸用疫苗如口蹄、馬立克、偽狂犬等），基因藥物生產(chǎn)（如EPO、TPA等），臨床用單抗（如抗人肝癌單抗、抗人肺單抗、WT3）等。
第一節(jié) 水與平衡鹽溶液
1.培養(yǎng)用水:體外培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)水質(zhì)特別敏感，對(duì)水的純度要求較高。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時(shí)也會(huì)影響細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會(huì)含有某些金屬離子，一般不作為培養(yǎng)用水。配制培養(yǎng)用液應(yīng)使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。最好用龍頭瓶貯存，存放時(shí)間一般不應(yīng)超過(guò)2周。
2.緩沖溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液：稍后介紹。
第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求
體外培養(yǎng)的細(xì)胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應(yīng)能滿(mǎn)足細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分、促生長(zhǎng)因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。
一、營(yíng)養(yǎng)成分 維持細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件一般包括以下幾個(gè)方面：
1.氨基酸：是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細(xì)胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴(lài)、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細(xì)胞代謝過(guò)程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來(lái)源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。 體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內(nèi)都含有必需氨基酸。
2.單糖：培養(yǎng)中的細(xì)胞可以進(jìn)行有氧與無(wú)氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。
體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。
3.維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。
4.無(wú)機(jī)離子與微量元素：細(xì)胞生長(zhǎng)除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。
二、促生長(zhǎng)因子及激素 已證實(shí)：各種激素、生長(zhǎng)因子對(duì)于維持細(xì)胞的功能、保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對(duì)許多細(xì)胞生長(zhǎng)有促生長(zhǎng)作用，如胰島素，它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對(duì)某一類(lèi)細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用，如氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，泌乳素有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)作用等。
三、滲透壓 細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。
四、pH 氣體也是細(xì)胞生存的必需條件之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和合成各種成分。一些細(xì)胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數(shù)細(xì)胞缺氧不能生存。在開(kāi)放培養(yǎng)時(shí)，一般置細(xì)胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關(guān)系。動(dòng)物細(xì)胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7．2~7．4℃在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，隨細(xì)胞數(shù)量的增多和代謝活動(dòng)的加強(qiáng)，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，PH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以精確地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。HEPES結(jié)合碳酸氫鈉使用，可提供更有效的緩沖體系，主要是防止pH值迅速變動(dòng)，但最大缺點(diǎn)是在開(kāi)放培養(yǎng)或觀察時(shí)難以維持正常的pH值。造成pH波動(dòng)主要是代謝產(chǎn)生的CO2，在封閉式培養(yǎng)過(guò)程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問(wèn)題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，并采用開(kāi)放培養(yǎng)，使細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2及時(shí)溢出培養(yǎng)瓶，再通過(guò)穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度（5％），與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。
五、無(wú)毒、無(wú)污染 體外生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒(méi)有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到無(wú)化學(xué)物質(zhì)污染、無(wú)微生物污染（如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）、無(wú)其他對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補(bǔ)體）。對(duì)于天然培養(yǎng)基，污染主要來(lái)源于取材過(guò)程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作。對(duì)于合成培養(yǎng)基，污染主要來(lái)源于配制過(guò)程，配制所用的水，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴(yán)格過(guò)濾除菌。
第三節(jié) 天然細(xì)胞培養(yǎng)基
天然培養(yǎng)基是指來(lái)自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類(lèi)培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過(guò)程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類(lèi)物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也是必不可少。
一、血清(serum)細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質(zhì)量又是關(guān)鍵，而培養(yǎng)基的主要成份中動(dòng)物血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動(dòng)物血清的應(yīng)用中牛血清又是最為廣泛的，所以血清是醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品中重要的原材料之一。保證血清質(zhì)量也是促進(jìn)生物制品質(zhì)量提高的重要環(huán)節(jié)。
1.血清種類(lèi):目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的原因：來(lái)源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)用考驗(yàn)人們對(duì)其有比較深入的理解。牛血清對(duì)絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細(xì)胞時(shí)使用其他動(dòng)物血清更合適。
牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)最高的，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少。
2.血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等，這些物質(zhì)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或抑制生長(zhǎng)活性是達(dá)到生理平衡的。對(duì)血清的成分和作用的研究雖有很大進(jìn)展，但仍存在一些問(wèn)題。主要是：
第一:血清的成份可能有幾百種之多，目前對(duì)其準(zhǔn)確的成份、含量及其作用機(jī)制仍不清楚，尤其是對(duì)其中一些多肽類(lèi)生長(zhǎng)因子、激素和脂類(lèi)等尚未充分認(rèn)識(shí)，這給研究工作帶來(lái)許多困難；
第二:血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)性受到限制；
第三:不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認(rèn)為是“瓶中惡化”的原因之一。
3.血清主要作用：
●提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)物、脂類(lèi)物質(zhì)、核酸衍生物等，是細(xì)胞生長(zhǎng)必須的物質(zhì)。
●提供激素和各種生長(zhǎng)因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素（氫化可的松、地塞米松）、類(lèi)固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血小板生長(zhǎng)因子等。
●提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用。
●提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷。
●對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用：有一些細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來(lái)終止胰蛋白酶的消化作用。因?yàn)橐鹊鞍酌敢呀?jīng)被廣泛用于貼壁細(xì)胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時(shí)，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們?cè)诖x解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。
4.細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)
血清成分復(fù)雜，雖含許多對(duì)細(xì)胞有利成分，也含有對(duì)細(xì)胞有害的成分，使血清有幾個(gè)明顯的缺點(diǎn)：
●對(duì)大多數(shù)細(xì)胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過(guò)程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進(jìn)某些細(xì)胞的生長(zhǎng)（成纖維細(xì)胞）同時(shí)抑制另一類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)（表皮細(xì)胞）。
●血清含一些對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來(lái)自高度繁殖細(xì)胞的多胺反應(yīng)（如精胺、亞精胺）形成有細(xì)胞毒性作用的聚精胺。補(bǔ)體、抗體、細(xì)菌毒素等都會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至造成細(xì)胞死亡。
●動(dòng)物個(gè)體不同，血清產(chǎn)地、批號(hào)不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致。
●取材中可能帶入支原體、病毒，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或?qū)嶒?yàn)結(jié)果不可靠性。
●血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。
●大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來(lái)源越來(lái)越困難，價(jià)格昂貴，是構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)生產(chǎn)成本的主要部分之一。
5.血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素：一是取材對(duì)象，二是取材過(guò)程。用于取材的動(dòng)物應(yīng)健康無(wú)病并且在指定的出生天數(shù)之內(nèi)，取材過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行，制備出的血清要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定。WHO公布的《用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求：
▲牛血清必須來(lái)自有文件證明無(wú)牛海綿狀腦病的牛群或國(guó)家。并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測(cè)系統(tǒng)。
▲有些國(guó)家還要求牛血清來(lái)自未用過(guò)反芻動(dòng)物蛋白飼料的牛群。
▲證明所用牛血清中不含對(duì)所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。
▲血清要通過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，保證無(wú)菌。
▲無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國(guó)家要求無(wú)細(xì)菌噬菌體污染。
▲對(duì)細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。
我國(guó)在對(duì)牛血清的質(zhì)量2000年版《中國(guó)生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》中提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求。包括蛋白質(zhì)含量，細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素，支持細(xì)胞增殖檢查。
血清質(zhì)量的鑒定一般包括以下幾個(gè)方面：
●理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應(yīng)小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。
●微生物檢測(cè)：包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對(duì)支原體、病毒的檢測(cè)，支原體是一種很小的微生物，可通過(guò)孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺(jué)，細(xì)胞也能生長(zhǎng)繁殖，但會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢測(cè)支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。
●促生長(zhǎng)效果：這是血清重要的特性之一，應(yīng)當(dāng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)檢測(cè)。有兩種方法：克隆形成率、貼瓶率測(cè)定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。
(1)克隆形成率測(cè)定:一般以懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞為培養(yǎng)對(duì)象，按有限稀釋法做克隆化培養(yǎng)，將不同批號(hào)的血清配制成不同濃度的培養(yǎng)基，細(xì)胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul，培養(yǎng)一定時(shí)間，統(tǒng)計(jì)有克隆生長(zhǎng)的孔，計(jì)算出百分比，再與對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)血清相比較，就可看出不同批號(hào)血清間的區(qū)別。比較低的濃度，更能觀察出血清質(zhì)量間的細(xì)微差別。
(2)貼瓶率測(cè)定:是以貼壁細(xì)胞為培養(yǎng)對(duì)象，將細(xì)胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個(gè)細(xì)胞，以不同濃度的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時(shí)間后棄培養(yǎng)基，染色后統(tǒng)計(jì)集落數(shù)，計(jì)算出集落數(shù)占接種細(xì)胞數(shù)的百分比，同樣再與標(biāo)準(zhǔn)血清比較，判斷血清質(zhì)量高低。
(3)連續(xù)傳代培養(yǎng)法:是將細(xì)胞培養(yǎng)于3個(gè)一定體積的培養(yǎng)瓶中，待測(cè)血清配制為5％濃度，一般于第七天收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取平均值，中間可以更換一次培養(yǎng)基。連續(xù)測(cè)試三個(gè)周期以上，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，并將每次的計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)血清的測(cè)試結(jié)果比較。
●對(duì)于使用者，判斷血清質(zhì)量先從外觀入手。好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無(wú)沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說(shuō)明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性；若血清呈棕紅色，說(shuō)明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時(shí)有溶血現(xiàn)象；如果搖晃時(shí)感覺(jué)液體稀薄，說(shuō)明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進(jìn)一步了解血清的質(zhì)量，則應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)某些細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。
6.血清的使用與儲(chǔ)存:正確的使用及保存血清，才能使血清發(fā)揮應(yīng)有的作用。
●使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。血清經(jīng)過(guò)滅活也會(huì)損失一些對(duì)細(xì)胞有利的成分，如生長(zhǎng)因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認(rèn)血清中不含補(bǔ)體成分。對(duì)于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。
●儲(chǔ)存條件：血清一般儲(chǔ)存于－20℃，同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融。購(gòu)買(mǎi)大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲(chǔ)存于－20℃，使用前融化。融化時(shí)最好現(xiàn)置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長(zhǎng)時(shí)間存放，應(yīng)盡快使用。
●使用濃度：自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5－20％，最常用是10％。過(guò)多血清容易使培養(yǎng)中的細(xì)胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無(wú)限細(xì)胞系，迅速生長(zhǎng)之后容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。
●采購(gòu)血清時(shí)，最好先從供應(yīng)商處索取樣品進(jìn)行試驗(yàn)，選定一批后就要保留足夠使用6個(gè)月至1年的量，直至用另一批經(jīng)過(guò)預(yù)先試驗(yàn)的樣品代替。
二、胚胎浸出液
胚胎浸出液(embryonic extract)是早期動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的天然培養(yǎng)基，現(xiàn)已很少使用。
三、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸，是常用的天然培養(yǎng)基，可用于許多細(xì)胞和原代細(xì)胞的培養(yǎng)。
第四節(jié) 合成細(xì)胞培養(yǎng)基
合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成、人工設(shè)計(jì)、配制的培養(yǎng)基。它有一定的配方，是一種理想的培養(yǎng)基。目前合成培養(yǎng)基多達(dá)10多余種，有的培養(yǎng)基仍在不斷進(jìn)行改良。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基，目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標(biāo)準(zhǔn)化的商品，從最初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無(wú)血清培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的普及發(fā)展。
一、基本組分 基本培養(yǎng)基包括四大類(lèi)物質(zhì)：無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。
●無(wú)機(jī)鹽：CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。
●氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴(lài)、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類(lèi)轉(zhuǎn)化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)特別重要，能促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來(lái)源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中最好單獨(dú)配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。
●維生素：是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的一種生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對(duì)細(xì)胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補(bǔ)充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是不可缺少的，對(duì)具有合成膠原能力的細(xì)胞更為重要。
●碳水化合物：是細(xì)胞生命的能量來(lái)源，有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，幾乎所有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。
●葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不完全氧化的產(chǎn)物。研究表明，體外培養(yǎng)條件下95％的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，這降低了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝效率，降低培養(yǎng)基pH值，增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下，NADH轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蘋(píng)果酸－天冬氨酸穿梭系統(tǒng)活性低而不能將糖酵解產(chǎn)生的NADH氧化磷酸化為NAD+，細(xì)胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸與NADH反應(yīng)生產(chǎn)乳酸和NAD+，從而保證了糖酵解的順利進(jìn)行。另一個(gè)可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環(huán)的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導(dǎo)致糖酵解與TCA循環(huán)的失衡。因此體外培養(yǎng)條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解，產(chǎn)生過(guò)量的乳酸。減少乳酸生產(chǎn)最常用的方法是限制培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過(guò)低可造成細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。該方法需要對(duì)葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產(chǎn)速率以及目的蛋白的表達(dá)量等參數(shù)進(jìn)行綜合考慮方可應(yīng)用。
在目前常用的培養(yǎng)基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的主要能源，其能量代謝通路與體內(nèi)完全不同，表現(xiàn)為葡萄糖主要經(jīng)糖酵解途徑為細(xì)胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過(guò)不完全氧化途徑，另一小部分通過(guò)完全氧化為細(xì)胞供能。因此，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑，使之能促進(jìn)細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成，同時(shí)減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。
許多動(dòng)物細(xì)胞如CHO、BHK和雜交瘤細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)而言，二者的快速利用并非細(xì)胞必需；相反相當(dāng)一部分轉(zhuǎn)化為代謝廢物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細(xì)胞生長(zhǎng)以及產(chǎn)品質(zhì)量。減少這兩種代謝產(chǎn)物的積累，是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究的重要方向。
氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產(chǎn)生的。限制培養(yǎng)基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。
●除了以上與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的物質(zhì)以外，培養(yǎng)基中一般還要加入酚紅（當(dāng)溶液酸性時(shí)pH小于6.8呈黃色；當(dāng)溶液堿性時(shí)pH大于8.4呈紅色），一種pH指示劑。
●在較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類(lèi))以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養(yǎng)液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。
二、常用細(xì)胞培養(yǎng)基
(1).MEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(2).DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(3)RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(4).199細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(5).水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(6)歐氏平衡鹽（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(7)F-10,F-12細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(8)其它類(lèi)型細(xì)胞培養(yǎng)基
三、干粉培養(yǎng)基的配制
配制培養(yǎng)基要注意以下問(wèn)題：
●認(rèn)真閱讀說(shuō)明書(shū)。說(shuō)明書(shū)都注明干粉不包含的成分，常見(jiàn)的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。
●配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。
●配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。
●所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。
●配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過(guò)濾，無(wú)菌保存于4度。
●液體培養(yǎng)基主要是為了科研工作的方便而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，它是一種滅菌后保證無(wú)菌的溶液，必要時(shí)可制成無(wú)內(nèi)毒素等的溶液，可節(jié)省科研人員的工作量。
配制方法
●在一個(gè)盡可能接近總體積的容器中加入比預(yù)期培養(yǎng)基總體積少5％的雙蒸水。
●在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養(yǎng)基，輕輕攪拌，不要加熱。
●水洗包裝袋的內(nèi)部，轉(zhuǎn)移全部的痕量干粉到容器內(nèi)。
●加NaHCO3到培養(yǎng)基中。
●用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過(guò)分?jǐn)嚢琛?span lang="EN-US">
●通過(guò)緩慢攪拌加入1N NaOH 或1N HCL調(diào)節(jié)pH值，由于pH值在過(guò)濾時(shí)會(huì)上升0.1到0.3，因 而調(diào)節(jié)pH值使它比最終想要的pH值低0.2到0.3。培養(yǎng)基在過(guò)濾前要保持密封。
第五節(jié) 無(wú)血清技術(shù)及其培養(yǎng)基
經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無(wú)血清培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一大趨勢(shì)。采用無(wú)血清培養(yǎng)可降低生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。
無(wú)血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿(mǎn)足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要求，但對(duì)有些實(shí)驗(yàn)卻不適合，如觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長(zhǎng)因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長(zhǎng)因子；又如需要測(cè)定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長(zhǎng)因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。因此研制出無(wú)血清培養(yǎng)基一直是生物科學(xué)工作者努力的目標(biāo)。上海恒利安生物科技有限公司已成功開(kāi)發(fā)了商業(yè)化的多種無(wú)血清培養(yǎng)基，可滿(mǎn)足眾多廠商的需求。
一、無(wú)血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。
用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，多數(shù)呈貼壁生長(zhǎng)或兼性貼壁生長(zhǎng)；而當(dāng)其在無(wú)血清、無(wú)蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細(xì)胞往往以懸浮形式生長(zhǎng)。
添加組分包括以下幾大類(lèi)物質(zhì)：
(1）促貼壁物質(zhì)：許多細(xì)胞必須貼壁才能生長(zhǎng)，這種情況下無(wú)血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子，一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對(duì)許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來(lái)自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成肌細(xì)胞等。
(2）促生長(zhǎng)因子及激素：針對(duì)不同細(xì)胞添加不同的生長(zhǎng)因子。激素也是刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞必不可少的，如胰島素。
(3）酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無(wú)血清培養(yǎng)基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制劑。
(4）結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：常見(jiàn)如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。
(5)微量元素：硒是最常見(jiàn)的。
二、使用方法:目前，血清仍是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不良時(shí)，常常會(huì)先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛以后，再換成無(wú)血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無(wú)血清培養(yǎng)。在降低過(guò)程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細(xì)胞能夠長(zhǎng)期培養(yǎng)于無(wú)血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)之前，要留有種子細(xì)胞，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。
為了使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞：
●處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期
●>90% 活細(xì)胞率
●適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種
有兩種方法使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）:
1. 直接適應(yīng)——細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）中。
一些類(lèi)型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基。對(duì)于直接適應(yīng)，接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×105~3.5×105細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml時(shí)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2×106~4×106細(xì)胞/ml時(shí)，細(xì)胞完全適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基。每隔3~5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。
2. 連續(xù)適應(yīng)——分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。
●以2倍正常接種密度接種生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基：25％SFM 混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。
●當(dāng)細(xì)胞密度>5×105細(xì)胞/ml時(shí)，以2×105到3×105細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
●以2×106到3×106細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25％有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。
●當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
●每隔3到5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。
建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。
在適應(yīng)過(guò)程中，最好不要讓細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。
細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清：許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含FBS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過(guò)下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí)，傳代細(xì)胞2到3次。
培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開(kāi)始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長(zhǎng)的延遲可能會(huì)發(fā)生，4允許進(jìn)行2到3次的傳代，使生長(zhǎng)率恢復(fù)到以前的水平。
特別需要強(qiáng)調(diào)的是：配制無(wú)血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o(wú)血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無(wú)血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。
三、使用無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)
●增加確定性
●性能更加一致
●容易進(jìn)行純化和下游加工
●細(xì)胞功能的精確評(píng)估
●增強(qiáng)生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量
●生理反應(yīng)性的較好對(duì)照
●增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)中介物的檢測(cè)
第六節(jié) 無(wú)蛋白培養(yǎng)基與限定化學(xué)成分培養(yǎng)基
一、無(wú)蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）:即不含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基仍含有較多的動(dòng)物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)來(lái)看，不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基又廣泛的應(yīng)用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)最終要應(yīng)用于人體，如果再生長(zhǎng)過(guò)程中使用了含有動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過(guò)程就比較復(fù)雜，最終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度。無(wú)蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢(shì)而出現(xiàn)的，許多無(wú)蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長(zhǎng)因子的作用。市場(chǎng)上已有適合多種細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)蛋白培養(yǎng)基。
二、限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemical defined medium,CDM):是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動(dòng)物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的CDM問(wèn)世，上海恒利安生物科技有限公司生產(chǎn)的水解乳蛋白培養(yǎng)基就屬于CDM。
第七節(jié) 其他細(xì)胞培養(yǎng)用液
在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，除了培養(yǎng)基外，還經(jīng)常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調(diào)整液等。
一、平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）:主要是由無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)。主要用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。最簡(jiǎn)單的BSS是Ringer。D-Hank's與Hank's的一個(gè)主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2的培養(yǎng)條件，Hank's平衡液僅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5%CO2的環(huán)境，若放入CO2培養(yǎng)相，溶液將迅速變酸，使用時(shí)應(yīng)注意。
配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過(guò)濾除菌或高溫滅菌。
二、消化液:取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)常常需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)時(shí)也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來(lái)，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時(shí)也用膠原酶（collagenase）溶液。
1.胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見(jiàn)有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hank's），因?yàn)檫@些物質(zhì)會(huì)對(duì)胰酶產(chǎn)生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至pH8左右，充分溶解，過(guò)濾除菌。過(guò)濾后可以再調(diào)只pH7.5，也可不調(diào)。
使用細(xì)胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的細(xì)胞清洗液（100ml細(xì)胞清洗液加0.5g胰酶），過(guò)濾除菌，分裝于4度保存。
2.EDTA溶液：EDTA溶液也常用來(lái)解離細(xì)胞，它的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶，配制后可過(guò)濾除菌，也可高溫消毒滅菌。
3.膠原酶溶液：膠原酶在上皮類(lèi)細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的最佳pH為6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制時(shí)可用PBS。
三、pH調(diào)整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。
1.NaHCO3溶液：NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說(shuō)明書(shū)的要求準(zhǔn)確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達(dá)到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說(shuō)明書(shū)所要求加入NaHCO3。此時(shí)常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達(dá)到所要求的pH環(huán)境。
2.HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開(kāi)放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES。
四、抗生素:常用的是青鏈霉素，俗稱(chēng)“雙抗溶液”。青霉素主要是對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。
五、谷氨酰胺補(bǔ)充液:谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時(shí)，要重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制時(shí)應(yīng)加溫30℃，完全溶解后過(guò)濾除菌，分裝至小瓶，儲(chǔ)存于－20℃。使用時(shí)，在每100ml培養(yǎng)液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1~4mmol/L。
六、二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）
在細(xì)胞培養(yǎng)液中L-谷氨酰胺是大部分細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分；而L-谷氨酰胺是一種并不穩(wěn)定的氨基酸，在中性的水溶液中會(huì)自發(fā)降解；需要頻繁地補(bǔ)加L-谷氨酰胺。因而在培養(yǎng)操作過(guò)程中經(jīng)常：
（1）頻繁打開(kāi)蓋子，增加了破壞無(wú)菌狀態(tài)的可能性；
（2）過(guò)多的追加L-谷氨酰胺，增加了培養(yǎng)基中氨的毒性水平。
二肽谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨最少!
二肽谷氨酰胺在細(xì)胞內(nèi)被氨肽酶（E.C.3.4.11.2）所水解，產(chǎn)生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分細(xì)胞系統(tǒng)中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是最優(yōu)替代物，它無(wú)需適應(yīng)；既可用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，也適合于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。
