細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)談
細(xì)胞生存所需營養(yǎng)和添加物
l 氨基酸 合成蛋白質(zhì)。
l 糖 葡萄糖為主，提供能量代謝。
l 激素 很多激素具有促細(xì)胞生長作用
l 谷氨酰胺 促進(jìn)氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜，是核酸的成分。（注意：備用培基放置15天后需要補(bǔ)充谷氨酰胺）
l 抗菌素 青霉素100單位/ 毫升、鏈霉素100微克/毫升，制霉菌素25單位/毫升。
l 微量元素
l 生物刺激源 有些細(xì)胞須特殊刺激因子，例ECGF、NGF、TGF、FGF、HGF、EGF等。
l 生長基質(zhì)成分 膠原、纖維連接蛋白、明膠、多聚賴氨酸。
l 細(xì)胞生長的密度依賴性 單個(gè)細(xì)胞不易生長，要加同種動(dòng)物巨噬細(xì)胞補(bǔ)充密度，一般用腹腔巨噬細(xì)胞，105/ml。
血清：
l 1.促細(xì)胞生長因子，維生素, 激素及營養(yǎng)物質(zhì)，其中的蛋白可解除脂肪酸、重金屬離子、蛋白酶對(duì)細(xì)胞的毒性作用。
l 2.促進(jìn)細(xì)胞貼壁。
l 3.小牛血清和胎牛血清應(yīng)用最多，有的血清對(duì)細(xì)胞有毒性，要篩選。胎盤血清較成人血清好（胎盤血清含豐富的生長激素）
l 4.AB型血清無凝集素，可廣泛使用自身血清在自身細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)用較好。
l 5.馬血清、雞血清在某些細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)用。
l 應(yīng)用：須無菌，不溶血，分裝保存
無菌操作
l 無菌室每周用過氧乙酸加紫外線消毒1一2次，
l 實(shí)驗(yàn)前，將實(shí)驗(yàn)器材放入超凈臺(tái)，同時(shí)啟動(dòng)風(fēng)機(jī)紫外線照射30分鐘后消毒完畢，使凈化臺(tái)內(nèi)空氣和臺(tái)面構(gòu)成無菌環(huán)境。
l 手指不能觸及器材使用端，若碰到要更換。減少手與器材的接觸面積，
l 一切操作都要在火焰周圍進(jìn)行，避免手從瓶口或其他器材上方經(jīng)過，瓶口要經(jīng)火焰消毒。
l 培養(yǎng)用液要專管專用，勤換吸管，防止擴(kuò)大污染和交叉污染。
l 操作者動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，盡量避免空氣流動(dòng)。
組織分離方法：
l 離心法：羊水，胸腹水、骨髓等，用細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心分離細(xì)胞。
l 組織切割法：無菌剝離脂肪及結(jié)締組織，用含抗菌素的培養(yǎng)液洗滌去血液，用眼科剪剪成
l 消化分離法：
l a 胰蛋白酶消化法: 用不含Ca++、Mg++的PBS配成0.1—0.25%的濃度，PH7.6，多用于貼附細(xì)胞傳代。在做原代組織培養(yǎng)時(shí)可用胰酶松散組織，但不得超過30分鐘。蛋白可吸附此酶，因此被消化的細(xì)胞要先洗去培養(yǎng)液。
l b. 膠原酶消化法：主要用于纖維間質(zhì)多的組織、軟骨組織的消化，不受Ca++，Mg++影響，濃度0.1－0.3%，
l c. EDTA消化應(yīng)不含Ca++、Mg++，EDTA可與Ca++、Mg++結(jié)合使細(xì)胞松散。濃度0.02％。
細(xì)胞消化傳代
l 消化液 0.25％胰蛋白酶或0.1％胰酶含0.02%EDTA。
l 方法 1.懸浮細(xì)胞采用離心法傳代或直接傳代法。2.貼壁細(xì)胞傳代用酶消化法：即平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞二次，加消化液，以剛好覆蓋細(xì)胞為宜。放入
細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
為了長期保存細(xì)胞、須凍存，可存數(shù)年。
l 凍存液： 培養(yǎng)液7份，血清2份，二甲基亞砜（DMSO）1份， 。
l 凍存方法： 凍存細(xì)胞的前一天換培養(yǎng)液，貼壁細(xì)胞經(jīng)常規(guī)消化，洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度約106/ml, 用彈指法將細(xì)胞打散，逐滴加入冷的凍存液，迅速加入凍存管中，1.5ml/管。做好標(biāo)記，
l 復(fù)蘇方法: 備
細(xì)胞運(yùn)輸
l 1.長距離運(yùn)輸 選擇生長良好的單層細(xì)胞加培養(yǎng)液至瓶頸，保留微量空氣，擰緊瓶蓋，用膠帶封好，包裹棉花，放在貼身口袋即可。到達(dá)目的地，吸出多于培養(yǎng)液（此液可繼續(xù)使用），按常規(guī)培養(yǎng)。
l 2.短距離運(yùn)輸 （幾小時(shí)）僅留少量培養(yǎng)液，防止細(xì)胞干燥，將細(xì)胞面朝上帶回。
培養(yǎng)中細(xì)胞生長情況的識(shí)別
l 細(xì)胞生長
貼壁細(xì)胞增殖向周圍擴(kuò)張，互相融合連成片，可見細(xì)胞隆起飽滿。 懸浮細(xì)胞呈圓形，具有折光性，大小不一，細(xì)胞壁光滑，透明無顆粒，細(xì)胞增殖旺盛時(shí)培養(yǎng)液易變酸。應(yīng)及時(shí)更換培養(yǎng)液。
l 細(xì)胞死亡
表現(xiàn)：貼壁細(xì)胞開始回縮變圓或成細(xì)絲狀，細(xì)胞間隙增大，胞壁增厚，胞內(nèi)顆粒增加，粗糙，脫落，崩潰解體。懸浮細(xì)胞無光澤，胞內(nèi)顆粒呈棕黑色，最后液化消失。
原因：污染，PH不適，谷氨酰胺過期，血清質(zhì)量不佳，培養(yǎng)液過期和未及時(shí)換培養(yǎng)液，膠塞燒燃產(chǎn)生毒物，支原體污染，培養(yǎng)器皿不干凈，水不純等復(fù)雜原因。
商用細(xì)胞庫
美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC) 。
地址： American Type Culture Collection， Rockville, maryland 20852,USA。
ATCC網(wǎng)址：http//www.atcc.org/
中國典型培養(yǎng)物保藏中心( China Center Type Culture Collection， CCTCC)
地址：武漢大學(xué)生命科學(xué)院中國典型培養(yǎng)物保藏中心(郵政編碼430072)聯(lián)系電話：027－87682378
中科院細(xì)胞庫 網(wǎng)址http//www.cell.ac.cn/cellbank/。
地址：上海岳陽路320號(hào)中國科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫
（郵政編碼：200031）。聯(lián)系電話：021－64315030－2052
細(xì)胞培養(yǎng)用品的消毒和處理
l 玻璃用品清洗：（新玻璃用品用5%鹽酸浸泡）清水沖洗→洗滌劑刷→清水→干→清潔液（重鉻酸鉀
l 塑料用品回收性清洗：
清水沖洗→洗滌劑刷→清水→干→清潔液（重鉻酸鉀
l 濾器：生物制劑均應(yīng)過濾除菌。一次性濾器不能回收，有大小不等規(guī)格。
l 橡皮塞： 肥皂煮→清水洗，不要用腐蝕性液體浸泡，不宜高壓，微波煮5-10min除菌。
空氣消毒：紫外線，乳酸蒸氣。
