一、實驗材料:
菌株λ噬菌體溶原株 :Escherichia coli K12 WK 6 λ
λ噬菌體敏感株:Escherichia coli C600 CR34
培養(yǎng)基:肉湯培養(yǎng)基;軟瓊脂:肉湯培養(yǎng)基中加入0.5%瓊脂10ml/管
培養(yǎng)條件: NA培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基,37℃
二、實驗步驟:
1.7.5ml 新鮮E.coli λ 菌液離心
2.菌沉淀用1ml無菌水懸浮
3. 菌懸液加在無菌平皿中央,開皿蓋,在安全柜的紫外燈下照射15秒(0.15mJ/cm2)
4.加入NA培養(yǎng)液5ml
5.37℃暗培養(yǎng)3小時
6.吸取以上菌液-培養(yǎng)液混合物,加1 - 0.5ml氯仿震蕩后離心12000rpm2分鐘
7.上清十倍稀釋至10-7
8.選擇10-5、10-6、10-7上清稀釋液100ul 與100ul受體菌(CCTCC AB 2013330)混合
9.37℃溫浴20分鐘
10.混合菌液加入到NA軟瓊脂(不燙手)中震蕩混勻倒NA平板
三、實驗結(jié)果:
1.稀釋度為10-4的平板:布滿噬斑不可數(shù)
2.稀釋度為10-5的平板:噬斑346個
3.稀釋度為10-6的平板:噬斑37個
4.稀釋度為10-7的平板:噬斑4個
四、實驗建議:
1.噬菌體液體放置在室溫下兩周會導(dǎo)致數(shù)量下降一個數(shù)量級。
2.宿主菌必須是噬菌體敏感菌株CCTCC AB 2013330,教學(xué)用普通大腸菌和噬菌體溶原菌株不能產(chǎn)生噬菌斑。
3.瓊脂的濃度(1.5%-2.0%),過高或過低的瓊脂含量均不能達(dá)到好的效果。
4.噬菌體與細(xì)胞的比例,測定噬菌體效價應(yīng)采用低感染復(fù)數(shù)。
5.指示菌密度是在平板上獲得清晰噬菌斑效果的重要因素之一,其細(xì)胞密度不宜過高。一般控制在1ⅹ107個細(xì)胞/ml為宜。
圖1. 上一排為平板背面照片,下一排為平板正面照片。