一種基于λ噬菌體Red重組酶的同源重組系統(tǒng)進行基因敲除:首先構(gòu)建同源交換位點(AES)，隨后將其整合到特定菌株噬菌體基因組中，獲得噬菌粒(phasmid);將噬菌粒導(dǎo)入特定菌株，獲得整合有同源交換位點的重組噬菌體，經(jīng)體外擴增獲得高滴度的重組噬菌體，對特定菌株進行染;將轉(zhuǎn)染后的特定菌株涂布到含潮霉素抗性的固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng) 4-5 周，挑取單克隆，通過 PCR 等方式進行驗證。
主要原理是同源重組的方法，利用同源基因序列的交換將目的基因敲除。
（1）找一個溫敏型質(zhì)粒；
（2）用PCR方法擴增靶向基因兩側(cè)各200bp片段，并要加上適當?shù)拿盖形稽c；
（3）篩選一個合適的抗性基因；
（4）將抗性標記連接與兩個片段的中間，然后與溫敏質(zhì)粒連接；
（5）轉(zhuǎn)入菌株感受態(tài)中；
（6）通過合適的抗性篩選篩選陽性工程菌株。
二、服務(wù)流程
1.客戶提供敲除基因編號；
2.構(gòu)建同源臂及包裝噬菌體；
3.噬菌體感染菌并驗證陽性克隆；
4.提交特定菌株基因敲除菌株（液體）及實驗相關(guān)的引物、測序結(jié)果、詳細的結(jié)題報告。
服務(wù)周期4-6個月。
三、基于CRISPR/Cas9平臺的菌基因組改造實驗步驟
CRISPR/Cas9是一種在特定目標位置切割DNA的工具，Cas9蛋白可在sgRNA的引導(dǎo)下對特定基因進行剪切，
從而達到基因敲除、敲入以及修飾、調(diào)控等目的。
敲除：與常規(guī)的shRNA敲低不同，CRISPR/CAS9和sgRNA可特異性的在基因組水平造成堿基的缺失或插入（INDEL），
造成原有基因表達框的破壞，造成靶基因蛋白水平的完全敲除。
敲入：與常規(guī)病毒介導(dǎo)的過表達不同，CRISPR/CAS9和sgRNA在特定基因組位點切割后，可在帶有同源臂的修復(fù)模板引導(dǎo)下，
將待敲入的基因插入到目的位點，不同于病毒介導(dǎo)的隨機整合。
明舟生物推出CRISPR方法進行菌基因組改造服務(wù)（包括基因敲除、定點突變、定點插入外源序列等）。相比于傳統(tǒng)的基因敲除方法，該方法速度快，無痕；非常便于后續(xù)的實驗研究。
