報告基因（Reporter Gene）：通常指可編碼某種蛋白或酶，其表達產(chǎn)物容易被檢測，并且能與內(nèi)源性背景蛋白相區(qū)別的基因，通過它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控。
熒光素酶報告基因是指以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence)；
一、原理簡述
（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。
（2） 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞或其它相關的細胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比。
（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。
二、技術流程
（1） 用生物信息學方法分析并預測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
（2）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。
（3）篩選陽性克隆，測序。擴增克隆并提純質(zhì)粒備用。
（5） 培養(yǎng)293（或其它目的細胞），并接種于24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。
（6） 將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞。
（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測。
（9） 計算相對熒光強度，并與空載對照比較。
綠色熒光蛋白的發(fā)光原理
GFP的第65至67位的三個氨基酸（絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸）殘基，可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團。當?shù)鞍踪|(zhì)鏈折疊時，這段被深埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸片段，得以“親密接觸”，導致經(jīng)環(huán)化形成咪唑酮，并發(fā)生脫水反應。在分子氧存在的條件下，發(fā)色團可進一步發(fā)生氧化脫氫，最終成熟，形成可發(fā)射熒光的形式。具體過程為：在 O2存在下，GFP分子內(nèi)第67位甘氨酸的酰胺對第65位絲氨酸的羧基進行親核攻擊，形成第5位碳原子咪唑基；第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應之后，導致芳香團與咪唑基結(jié)合，并最終自發(fā)催化形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色。
GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问剑坏┲匦卤┞对诳諝饣蜓鯕庵?，GFP熒光便立即得到恢復。一般來說弱還原劑并不會影響GFP熒光，中度氧化劑如生物材料的固定，脫水劑戊二酸或甲醛等對GFP熒光影響也不大。
綠色熒光蛋白的發(fā)光特性
GFP吸收的光譜最大峰值為395nm（紫外），并有一個峰值為470nm的副吸收峰（藍光）；發(fā)射光譜最大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰（Shouder）。雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發(fā)光對細胞的傷害更小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。此外，GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽（FITC）很相似，兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強，特別是在450～490nm藍光波長下更穩(wěn)定。類似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標記的熒光抗體高，抗光漂白能力強，因此更適用于定量測定與分析。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應底物，因此GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。但因為GFP不是酶，熒光信號沒有酶學放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白，比如螢火蟲熒光素酶等。
