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第五章 常見組織細(xì)胞的培養(yǎng)方法

體內(nèi)組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時,所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似,但由于物種、個體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同,各自要求條件有一定差別,所采取的培養(yǎng)技術(shù)措施亦不盡相同,現(xiàn)介紹個別組織細(xì)胞培養(yǎng)的要點(diǎn)如下
第一節(jié) 上皮細(xì)胞培養(yǎng)
上皮細(xì)胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于上皮組織,故上皮細(xì)胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細(xì)胞培養(yǎng)中常混雜有成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)時生長速度往往超過上皮細(xì)胞,并難以純化,同時上皮細(xì)胞難以在體外長期生存,因此純化和延長生存時間是培養(yǎng)關(guān)鍵。
體內(nèi)上皮細(xì)胞生長在膠原構(gòu)成的基膜,因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長,另外人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層(用射線照射后)時,細(xì)胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2+含量和溫度,向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子,均有利于表皮細(xì)胞生長。
以表皮細(xì)胞為例,用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞,其法如下(黑木凳志夫 1981
1
、取材:外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊,早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好,取角化層薄者,切成0.51平方厘米小塊。
2
、置0.02%EDTA中,室溫,5分鐘。
3
、換入0.25%胰蛋白酶中,4℃過夜。
4
、分離:取出皮塊,用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。
5
、取出表皮,剪成更小的塊后,置0.25%胰酶中,37℃,30—60分鐘。
6
、反復(fù)吹打,制成懸液。
7
、培養(yǎng):用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后,低速離心,吸去上清。
8
、直接加入培養(yǎng)基(Eagle20%小牛血清)制成細(xì)胞懸液,接種入培養(yǎng)瓶,CO2溫箱培養(yǎng)。
第二節(jié) 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)
內(nèi)皮細(xì)胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細(xì)胞,對于研究內(nèi)皮細(xì)胞再生、腫瘤促血管生長因子(TAF)等有很大價值。
研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便,其法如下:
1
、產(chǎn)后新鮮臍帶,無菌剪取10—15厘米長一段,如不能立即培養(yǎng),可于12小時內(nèi)保存于4℃。
2
、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血,在入口處用線繩扎緊,以防液體返流。
3
、用血管鉗夾緊臍帶一端,從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶,充滿血管,消化3—10分鐘;注入口用線繩扎,以防液體返流。
4
、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液,于離心管中,注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后,一并注入離心管中(此步驟可重復(fù))。
5
、離心去上清,加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,接種入培養(yǎng)器皿中,置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見細(xì)胞長成單層。
第三節(jié) 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)
神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元)不易培養(yǎng),只有在適宜情況下,如接種在膠原底層上,或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時,可出現(xiàn)一定程度的分化,長出突起等現(xiàn)象,但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。
人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),不僅能獲得生長的膠質(zhì)細(xì)胞,也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說來,膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)定,不易自發(fā)轉(zhuǎn)化,但對外界因素仍保持很好的敏感性,可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。
一. 設(shè)備: 無菌操作設(shè)備。
二. 大型設(shè)備CO2培養(yǎng)箱:恒溫5%、10%CO2維持培養(yǎng)液中pH值。
倒置顯微鏡:用于每天觀察貼壁細(xì)胞生長情況。
解剖顯微鏡,用于準(zhǔn)確地取材。
常溫冰箱:-4℃,用于保存各種培養(yǎng)液,解剖液和鼠尾膠。
低溫冰箱:-20--80℃,用于儲存血清酶,貴重物品和試劑。
電熱干烤箱:用于消毒玻璃器皿。
高壓消毒鍋:用于消毒培養(yǎng)皿,手術(shù)器械。
過濾器:配制解剖液、培養(yǎng)液,必須過濾后才可使用,以去除細(xì)菌。
滲透壓儀,pH劑,天平等。
三. 培養(yǎng)器皿及手術(shù)器械
1
培養(yǎng)皿:常用35mm塑料及玻璃皿,解剖取材用15mm-90mm直徑。
2
培養(yǎng)板,24-40孔,可用于開放培養(yǎng)。
3
培養(yǎng)瓶:
4
吸管,常用1,5,10ml,均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。
5
各類培養(yǎng)液貯存器。
6
小型手術(shù)器械。
準(zhǔn)備:
一 配制培養(yǎng)液
1) 解剖液:以無機(jī)鹽(去除Ca2+, Mg2+)加葡萄糖配制成PBS緩沖液,保持一定的滲透壓和pH值。
2) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM):主要為多種氨基酸,加入葡萄糖,雙蒸餾水溶解。
3) 接種培養(yǎng)液:用于胰酶消化后的細(xì)胞分散,做成細(xì)胞懸液,其成分為MEM1%谷氨酰胺,另加入10%馬血清,當(dāng)天配制。
4) 維持培養(yǎng)液:接種后24h,全部換成此液,后每2周換一次,每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清,1%谷氨酰胺,及適量的支持性營養(yǎng)物質(zhì)。
二 培養(yǎng)基質(zhì) 常用鼠尾膠、小牛皮膠,多聚賴氨酸,再涂膠
三 消毒培養(yǎng)皿的備用。所有培養(yǎng)器皿均需清水沖洗2-3d,達(dá)兩次ddH2O,每遍洗刷3-4次,加塞包裝,置于烤箱中干燥消毒,于培養(yǎng)前1天進(jìn)行。
神經(jīng)細(xì)胞分散培養(yǎng)
(一) 選材 常用胚胎動物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d,新生鼠或胎鼠(12-14d)或人胚胎。不過也有認(rèn)為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以19d為宜,小鼠以18d為宜,大鼠紋狀體以10d為宜;若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚,則黑質(zhì)以13d,紋狀體18-21d為宜;小腦以20-21d小鼠胚胎,所獲蒲氏細(xì)胞成活率高,顆粒細(xì)胞正在分化;脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng),常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎,取材易,神經(jīng)成活率高。
(二) 取材。腦則取出相應(yīng)組織,在解剖液中先剪碎,以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上,用小刀將其要成背腹兩側(cè),分別培養(yǎng)。
(三) 細(xì)胞分離與接種。神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min,移入接種液,停止消化,并洗去胰蛋白酶液,用細(xì)口吸管吹打細(xì)胞懸液,使其充分分散,如此多次,待沉淀后吸出上層細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),預(yù)置細(xì)胞密度,接種于培養(yǎng)皿(1×106),做電生理應(yīng)為5×105或更低。
(四) 抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長。培養(yǎng)3-5d后,也有人認(rèn)為培養(yǎng)7d后,用阿糖胞苷,或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長。
(五) 觀察。接種6-12h,開始貼壁,并有集合現(xiàn)象,細(xì)胞生長突起明顯,5-7d膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯,7-10d膠質(zhì)細(xì)胞成片于神經(jīng)細(xì)胞下面,形成地毯,2周時神經(jīng)細(xì)胞生長最豐滿,四周暈光明顯,一個月后,有些神經(jīng)細(xì)胞開始退化,變形,甚至出現(xiàn)空泡,一般培養(yǎng)2-4周最宜。
   
但神經(jīng)細(xì)胞只能增大,而不能增殖,只能原代,不能傳代,不會有細(xì)胞周期,而且隨培養(yǎng)時間的延長,細(xì)胞數(shù)量在下降,但膠質(zhì)細(xì)胞可以,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也可以。在培養(yǎng)過程中,早期9-12d時,有較多的神經(jīng)細(xì)胞死亡,這是第一次死亡階段,應(yīng)注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細(xì)胞一般突起長而多,且相互形成突觸。
(六) 常用培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)有:FCM的蛋白總量分析;膜片鉗與離子通道的分析;免疫組化分析;
但免疫組化分析應(yīng)注意,由于抗體直接作用于活細(xì)胞,不易穿透活細(xì)胞,故對核內(nèi)抗原定位時,首先考慮膜對抗體的通透性問題。常用化學(xué)試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。
在免疫組化中,或其它組織學(xué)染色中,常用不同的染色方法以區(qū)分不同細(xì)胞,如半乳糖腦苷脂對小樹突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記明顯;GFAP對星形膠質(zhì)細(xì)胞具有特異性染色等。這對研究神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細(xì)胞功能具有極大的應(yīng)用價值。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以往多被忽視,其在腦血管疾?。ㄈ缛毖該p傷)、退行性疾?。ㄈ?span lang="EN-US">AD
、PD)、損傷后膠質(zhì)細(xì)胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經(jīng)細(xì)胞功能和營養(yǎng)支持的物質(zhì)基礎(chǔ)。
第四節(jié) 肌組織細(xì)胞培養(yǎng)
各種肌組織均可用于培養(yǎng),以心肌和骨骼肌較實(shí)用。
(-)骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)
1
、出生12天的乳鼠,引頸處死。
2
、無菌取大腿肌組織,切成0.30.5cm2小塊后,用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化,無菌紗網(wǎng)或紗布濾過。
3
、計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度。
4
、快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。
5
、培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清,可加1%的胎汁以促進(jìn)分化。
接種在膠原或膠原的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化,明膠配置:用Hanks液配成0.01%明膠。
該細(xì)胞接種率約50%,細(xì)胞生長開始呈紡錘形,培養(yǎng)5052小時后出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止,此時可觀察到橫紋,一般在融合后二、三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象。
(二)心肌細(xì)胞培養(yǎng)
心肌細(xì)胞是最早的培養(yǎng)材料,Carrel曾長期培養(yǎng)過心肌組織,至今心肌仍不失為好的培養(yǎng)物,最常用的是雞胚心肌。
心肌比較容易培養(yǎng)和生長,可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法,均可獲良好的效果。取心室肌培養(yǎng)較好,原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形,培養(yǎng)成功時,一周后可見節(jié)律性收縮現(xiàn)象。
第五節(jié) 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)
巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞,有多種功能,是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細(xì)胞容易獲得,便于培養(yǎng),并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群,在條件適宜下可生活23周,多用做原代培養(yǎng),難以長期生存。
巨噬細(xì)胞也建有無限細(xì)胞系,大多來自小鼠,如P331S774A.1、RAW309Cr.l等,均獲惡性,培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能,易于傳代和瓶壁分離,但難以建株。
培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各樣方法和各種來源來獲取細(xì)胞,以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用,其法如下:
1
、實(shí)驗(yàn)前三天,向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml(勿注入腸內(nèi)!),以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞。
2
、引頸處死小鼠。
3
、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中35秒。
4
、置動物于解剖臺,用針頭固定四肢,持鑷撕開腹部皮膚,但勿傷及腹膜壁,把皮膚拉向上下兩側(cè),暴露出腹膜壁。
5
、用70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,同時用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁,使液體在腹腔內(nèi)流動。
6
、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè).使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。
7
、小心拔出針頭,把液體注入離心管。
8
4℃下250g離心10分鐘后,去上清,加10ml Eagle培養(yǎng)基。
9
、計(jì)數(shù)細(xì)胞。每只鼠可產(chǎn)生2030×106細(xì)胞,其中90%為巨噬細(xì)胞。
10
、以3×105個貼附細(xì)胞/平方厘米接種。
11
、接種數(shù)小時后,除去培養(yǎng)液,可去除其它白細(xì)胞,純化培養(yǎng)細(xì)胞,用Eagle液沖洗12次,再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中。
第六節(jié) 腎小球分離、移植培養(yǎng)
SD
大鼠頸椎脫臼法處死,75%乙醇浸泡12分鐘,2次,置超凈臺內(nèi),打開腹腔取出腎臟剪碎,置含Hank's液的無菌培養(yǎng)皿洗滌,置80目不銹鋼篩網(wǎng)上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過篩網(wǎng),濾過組織Hank's液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網(wǎng),濾過,去小組織塊,濾過物吸至200目不銹鋼篩網(wǎng),輕輕濾過,Hank's液洗滌1次,收集網(wǎng)上腎小球,鏡下觀察為分離良好的腎小球。
腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶,37℃消化20分鐘,加血清終止胰酶反應(yīng),離心除去膠原酶。處理過的腎小球計(jì)數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶,使腎小球大于60/cm2,加培養(yǎng)基510ml(培養(yǎng)基組成:F12—3T3上清115%馬血清;2.5%胎牛血清;胰島素5μg/ml;25ng/ml氫化可的松;5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白;25ng/ml前列腺素E1;甲狀腺素0.02ng/ml;D-纈氨酸150ng/ml)腎小球培養(yǎng)810天,去除腎小球未生長組分,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時,形態(tài)學(xué)觀察:細(xì)胞生長成單層多角型細(xì)胞,直徑約100μm。
第七節(jié) 裸小鼠移植瘤單細(xì)胞分離培養(yǎng)
無菌條件下取出小鼠移植瘤組織,剪成1mm3小塊,用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時,再加等體積0.2%胰酶消化58分鐘,在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置(分別作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接而成,濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細(xì)胞)來回推動注射器吹打組織以分離單細(xì)胞,終止酶消化方法同上。
常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細(xì)胞。