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第六章 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)

腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置,首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞。當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。另外腫瘤對人類是威脅最大的疾病。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。 
一、組織培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性
腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比,不論在體內(nèi)或在體外,在形態(tài)、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞,其差異較小,但也并非完全相同。培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞具以下突出特點:
(-)形態(tài)和性狀
培養(yǎng)中癌細(xì)胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài),大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰,核膜、核仁輪廓明顯,核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密,微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則,可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關(guān)。
(二)生長增殖
腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性,在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖,是因血清中含有很細(xì)胞增殖生長的因子,而癌細(xì)胞在低血清中(2%~5%)仍能生長。已證明腫瘤細(xì)胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后,出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長的現(xiàn)象,已成為檢測細(xì)胞惡變的一個指標(biāo)。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個細(xì)胞培養(yǎng)時,形成集落(克隆)的能力比正常細(xì)胞強。另外癌細(xì)胞增殖數(shù)量增多擴展時,接觸抑制消除,細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展,形成堆積物。
(三)永生性
永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無限傳代而不凋亡(Apoptosis)。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株都表現(xiàn)有這種性狀,體內(nèi)腫瘤細(xì)胞是否如此尚無直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡,從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細(xì)胞的永生性是否能反證它在體內(nèi)時同樣如此?也尚難肯定。從近年建立細(xì)胞系或株的過程說明,如果永生性是體內(nèi)腫瘤細(xì)胞所固有的,腫瘤細(xì)胞應(yīng)易于培養(yǎng)。事實上,多數(shù)腫瘤細(xì)胞初代培養(yǎng)時并不那么容易。生長增殖并不旺盛;經(jīng)過純化成單一化瘤細(xì)胞后,也大多增殖若干代后,便出現(xiàn)類似二倍體細(xì)胞培養(yǎng)中的停滯期。過此階段后才獲得永生性,順利傳代生長下去。從而說明體外腫瘤細(xì)胞的永生性有可能是體外培養(yǎng)后獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細(xì)胞系,如NIH3T3、Rat110T1/2等細(xì)胞證明,永生性和惡性(包括浸潤性)是兩種性狀,受不同基因調(diào)控,但卻有相關(guān)性??赡苡郎允羌?xì)胞惡變的階段。至少在體外是如此。
(四)浸潤性
浸潤性是腫瘤細(xì)胞擴張性增殖行為,培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時,能浸潤入其它組織細(xì)胞中,并有穿透人工隔膜生長的能力。
(五)異質(zhì)性
所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織;處于瘤體周邊區(qū)的細(xì)胞獲得血液供應(yīng)多,增殖旺盛,中心區(qū)有的細(xì)胞衰老退化,有的處于周期阻滯狀態(tài),那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱干細(xì)胞(Stem Cells)、只有這些干細(xì)胞才是支持腫瘤生長的成分。腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)時易于生長增殖;把干細(xì)胞分離出來的培養(yǎng)方法稱干細(xì)胞培養(yǎng)。
(六)細(xì)胞遺傳
大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變,如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細(xì)胞群常由多個細(xì)胞群組成,有干細(xì)胞系和數(shù)個亞系,并不斷進行著適應(yīng)性演變。
(七)其它
腫瘤細(xì)胞在體外不易生長的原因可能由于:
①依賴性:腫瘤細(xì)胞雖有較強克隆生長力,但仍有一定的群體性或與其它細(xì)胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互依存,二是腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的依賴。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細(xì)胞后也會同時消除或減弱這些依存關(guān)系,可能影響癌細(xì)胞增殖生長的活性;
②腫瘤細(xì)胞的自泌也會因分散培養(yǎng)而被稀釋,達(dá)不到腫瘤生長的需求,降低腫瘤細(xì)胞的生長增殖力;
③并非所有腫瘤細(xì)胞都有強的生長活力和長的Life Span,只有干細(xì)胞才有強的增殖生長能力,但這些細(xì)胞數(shù)量很少;
④離體培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。
二、培養(yǎng)方法
腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于:取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。在具體培養(yǎng)方法方面,腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無原則差別,初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。
1
.取材:
人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要,體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū),取材時盡量避免用退變組織,要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進行培養(yǎng),如因故不能立即培養(yǎng),可貯存于4℃中,但不宜栽過24小時。
2
.培養(yǎng)基:
腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格,一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對血清的需求比正常細(xì)胞低,正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長,腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大,是因腫瘤細(xì)胞有自泌(Autocrine)性產(chǎn)生促生長物質(zhì)之故。但這并不說明腫瘤細(xì)胞完全不需要這些成分。按不同細(xì)胞需要不同的生長因子;腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數(shù)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中仍需要生長因子。有的還需特異性生長因子〔如乳腺癌細(xì)胞等)。總之培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長因子培養(yǎng)更易成功。
3
.成纖維細(xì)胞的排除:
成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時混雜生長,致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長得快,最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。排除成纖維細(xì)胞有多種方法(表21)。

21 抑制成纖維細(xì)胞生長因素
方法
因素
組織細(xì)胞
選擇性附著

選擇性附著底物


匯合飼細(xì)胞層

選擇性培養(yǎng)基


胰蛋白酶
膠原酶
聚丙烯酰胺
聚四氟乙烯(Teflon
膠原(豬皮)
小鼠3T3
人胎小腸
D-
纈氨酸(Valine
MCDB-710
MCDB-153
Phenobarbitone
胚胎小腸、心肌、表皮
乳癌
各種腫瘤
轉(zhuǎn)化細(xì)胞
表皮細(xì)胞
表皮
正常和惡性乳腺上皮
結(jié)腸癌
腎組織
乳腺
表皮
肝細(xì)胞

注:上表結(jié)果為個別實驗室經(jīng)驗,僅供參考
 
三、成纖維細(xì)胞排除法
1
.機械刮除法
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲)、或裹少許脫脂棉制成,裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序為:
1)標(biāo)記:鏡下觀察,用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細(xì)胞的部位;
2)刮除:棄掉培養(yǎng)液,把無菌膠刮伸入瓶皿中,肉眼或顯微鏡窺視下,刮除無標(biāo)記空間;
3)用Hanks液沖洗一兩次,洗除被刮掉的細(xì)胞;
4)注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留,可重復(fù)刮除至完全除掉為止
2
.反復(fù)貼壁法
根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點,并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液,把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁,使兩類細(xì)胞相互分離,操作方法與傳代相同。
1)待細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后,倒出舊培養(yǎng)液,用胰酶消化后,Hanks 沖洗2次,加入不含血清的培養(yǎng)液,吹打制成細(xì)胞懸液;
2)取編號為此AB、C三個培養(yǎng)瓶;首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)520分鐘后,輕輕傾斜培養(yǎng)瓶,讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液,再接種入B培養(yǎng)瓶中后;向A瓶中補充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng);
3)培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞520分鐘后,接處理A的方法,把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中;再向B瓶中補加完全培養(yǎng)基。
當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后,均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功,次日觀察可見A瓶主要為成纖維細(xì)胞,B瓶兩類細(xì)胞相雜,C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時可反復(fù)處理多次,直至癌細(xì)胞純化為止。
3
.消化排除法
此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng),具體程序是:
1)先是用0.5%胰蛋白酶和0.02EDTA11)混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次,然后再換成新的混合液繼續(xù)消化,并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養(yǎng)瓶,到半數(shù)細(xì)胞脫落下來后,便立即停止消化;
2)把消化液吸入離心管中,離心去上清,吸入另瓶中,加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng);向原瓶內(nèi)也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后,成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落。經(jīng)過幾次反復(fù)處理,可能把成纖維細(xì)胞除凈。
4
.膠原酶消化法:
本法是利用成纖維細(xì)胞對膠原酶較為敏感的特點,通過消化進行選擇。
1)可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理,邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視,當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后,即終止消化;
2)用Hanks洗滌處理一次后,更換新培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞未被除凈,可再次重復(fù)。
5
.其它方法:
有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞生長的作用;也有人用聚蔗糖制備成比重1.0251.085的密度梯度離心液,加入細(xì)胞懸液后,在23℃中800g離心 10分種。在比重1.0251.050層為成纖維細(xì)胞,在比重1.0501.085層為上皮細(xì)胞,再經(jīng)過分離進行培養(yǎng)。最近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細(xì)胞生長的方法。
選用上述任何一種方法,都需進行試驗,取得必要經(jīng)驗,找出適合的條件,才能獲得好的效果。
四、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長率措施
根據(jù)人們的經(jīng)驗,腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng),建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難。當(dāng)腫瘤組織或細(xì)胞初代接種培養(yǎng)后,常出現(xiàn)以下幾種情況:
完全無細(xì)胞游出或移動;
有細(xì)胞移動和游出,但無細(xì)胞增殖,細(xì)胞長時間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代;
有細(xì)胞增殖,傳若干代后停止生長或衰退死亡;
傳數(shù)代后細(xì)胞增殖緩慢,經(jīng)過一段停滯期后,才又呈旺盛生長狀態(tài),形成穩(wěn)定生長的腫瘤傳代細(xì)胞系。
以上現(xiàn)象說明腫瘤細(xì)胞對體外生存條件有較高的要求,并需經(jīng)過對新環(huán)境的適應(yīng)才能生長,因此欲獲得好的培養(yǎng)效果,不能局限于一般培養(yǎng)法,必須采用一些特殊的措施。
1
.適宜底物:把經(jīng)過純化的細(xì)胞接種在不同的底物上,如鼠尾膠原底層、飼細(xì)胞層等。
2
.生長因子:應(yīng)用促細(xì)胞生長因子,向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細(xì)胞生長因子。根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促生長物,常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。
為提高腫瘤細(xì)胞對體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)力和增加有活力癌細(xì)胞(干細(xì)胞)的數(shù)量,可采用動物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后,再從動物體內(nèi)取出進行培養(yǎng),能提高體外培養(yǎng)的成功率。受體動物以裸鼠最好。
3.
動物體媒介培養(yǎng)方法:
1)瘤塊接種:取新鮮瘤組織,用Hanks液洗凈血污,切成13毫米小塊,用穿刺針頭吸一小瘤塊,用酒精棉球擦拭動物腹部后,直接刺入皮下,注入瘤塊;
2)飼養(yǎng)觀察,待腫瘤生長達(dá)較大體積后,剝?nèi)〕隽鼋M織;
3)進行體外培養(yǎng)。
4)為防止失敗,仍取部分瘤組織繼續(xù)在裸鼠體內(nèi)傳代。通過裸鼠媒介接種,有活力的腫瘤細(xì)胞數(shù)量增多,細(xì)胞培養(yǎng)易于成功。
腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法與培養(yǎng)正常細(xì)胞完全相同,但成功率比正常細(xì)胞高。
五、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測
一旦培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長成形態(tài)上單一的細(xì)胞群體或細(xì)胞系(或株)后,不論用于實驗研究還是建立細(xì)胞系,都需要做一系列的細(xì)胞生物學(xué)測定,主要的目的在于求得證明:
所培養(yǎng)的細(xì)胞系的確來源于原體內(nèi)具有惡性的細(xì)胞,而非正常細(xì)胞或其它細(xì)胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學(xué)性狀。測定項目數(shù)量無明確規(guī)定,根據(jù)需要而定,以下為常做的項目和要點。
【形態(tài)觀察】主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài),如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。
【細(xì)胞生長增殖】檢測細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞分裂指數(shù)、倍增時間、細(xì)胞周期時間。
【細(xì)胞核型分析】檢測核型特點,染色體數(shù)量、標(biāo)記染色體的有無、帶型等。
【凝集試驗】檢測凝集力。
【軟瓊脂培養(yǎng)】檢測集落形成能力。
【異體動物接種】向異體動物體內(nèi)(皮下)接種細(xì)胞懸液,觀察成瘤能力。
【其它】除上述項目外,根據(jù)需要還可做同位素標(biāo)記、組織化學(xué)成分分析,熒光顯微鏡觀察等。
在上述腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測中,最主要的為:異體動物(以用裸鼠為上)接種成瘤、軟瓊脂培養(yǎng)、核型分析、細(xì)胞骨架和電鏡觀察等幾項。當(dāng)然從分子細(xì)胞學(xué)角度考慮尚應(yīng)做癌基因和抗癌基因等的檢測,這些項目將在本書第二篇中介紹。
六、對腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株的評價
已建成的各種腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株,無疑都是可用的實驗對象。近年我國已建成的腫瘤細(xì)胞系已非常多,并獲得越來越廣泛的應(yīng)用。但根據(jù)研究者的經(jīng)驗,在使用這些細(xì)胞系時,應(yīng)持特別審慎態(tài)度,主要是應(yīng)考慮到這些細(xì)胞在長期傳代中有否發(fā)生遺傳性改變的可能。眾所周知,長期傳代細(xì)胞系染色體核型常是不穩(wěn)定的。另外也可能發(fā)生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結(jié)果可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)性狀上的變動。以近年建成的各種腫瘤細(xì)胞系為例,都已傳代少則幾十,多則百代以上后,才確認(rèn)建成了細(xì)胞系。這種情況下很難保證細(xì)胞從初代到建成時的性狀仍是一致的。
已如前述,癌細(xì)胞在培養(yǎng)中并非能很順利地傳下去,凡已長期傳代的細(xì)胞系,都已獲得不死性。當(dāng)前尚未完全確證所有癌細(xì)胞都具有不死性;因此尚難肯定在長期培養(yǎng)中的癌細(xì)胞的生物學(xué)性狀與體內(nèi)時仍完全相同(包括不死性)。據(jù)上述對用癌細(xì)胞系所獲實驗結(jié)果應(yīng)盡量做分析性的結(jié)論,避免做概括性的與體內(nèi)等同的結(jié)論,外推與體內(nèi)等同更是不妥的。廣泛來說,應(yīng)用各種較長時間培養(yǎng)細(xì)胞做實驗時,都應(yīng)如此。