取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶,75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶,拆下封口膜,放入37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置2-3小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),然后離心換用新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。
方法①:收集細(xì)胞,1000rpm離心5min,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
方法②:可選擇半數(shù)換液方式,棄去半數(shù)培養(yǎng)基后,將剩余細(xì)胞懸起,將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
貼壁細(xì)胞需要用胰酶進(jìn)行消化。
1)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心5min;
2)用適量的凍存液(FBS:DMSO=9 :1)重懸細(xì)胞,并放置于凍存管中;
3)先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h,然后將其移入-80℃過(guò)夜,24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。
1)從液氮中取出細(xì)胞凍存管(注意:佩戴防爆管面具),快速將其置入37℃水浴中解凍,直至凍存管中無(wú)結(jié)晶,然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁;
2)將凍存管中的細(xì)胞移至含10ml完全培養(yǎng)基的15ml離心管中, 1000rpm離心5min;
3)棄上清,沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸,接種25cm2培養(yǎng)瓶,于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
4)第二天,換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
注:培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)非完全培養(yǎng)基,請(qǐng)務(wù)必使用準(zhǔn)備好的新鮮培養(yǎng)基。懸浮細(xì)胞運(yùn)輸中會(huì)有少些細(xì)胞因?yàn)榕鲎擦呀猱a(chǎn)生碎片,收到細(xì)胞如碎片較多時(shí),胎牛血清可以用15%培養(yǎng)三天,利于細(xì)胞盡快恢復(fù)狀態(tài),細(xì)胞穩(wěn)定后再調(diào)回10%即可。